Anticorps monoclonal de lapin anti-Cas9 pour WB, IF/ICC, ELISA - Q99ZW2

Spécifications et paramètres principaux du produit

Contexte biologique : fonction et localisation de Cas9

• Cas9 (endonucléase Cas9/Csn1 associée à CRISPR) est une endonucléase d’ADN guidée par l’ARN de 158,4 kDa qui constitue le cœur enzymatique du système immunitaire adaptatif CRISPR-Cas de type II chez Streptococcus pyogenes. Références associées : PMID:21455174
• Dans son rôle biologique naturel, Cas9 protège les bactéries contre les plasmides invasifs et l’ADN viral en incorporant de courtes séquences étrangères (spacers) dans les loci CRISPR, fournissant une mémoire génétique pour une immunité spécifique de séquence. Références associées : PMID:21455174
• Cas9 nécessite deux petits ARN — un ARN CRISPR (crRNA) et un crRNA transactivateur (tracrRNA) — pour la liaison à l’ADN cible et l’activité nucléase ; elle est catalytiquement inactive en l’absence de ces ARN guides. Références associées : PMID:24270795 PMID:24476820
• La reconnaissance de la cible est régie par un court motif adjacent au protospacer (PAM ; 5'-NGG-3') au sein de la répétition CRISPR, qui permet de distinguer l’ADN propre de l’ADN étranger ; la liaison au PAM initie la séparation des brins d’ADN et la formation d’un hétéroduplex. Références associées : PMID:24476820
• Après reconnaissance du PAM, Cas9 catalyse le clivage endonucléolytique du brin cible non complémentaire au crRNA, suivi d’un rognage exonucléolytique de 3' vers 5' ; les deux étapes nucléasiques dépendent des ions magnésium ou manganèse. Références associées : PMID:24476820
• Lors de la maturation de l’ARN CRISPR, Cas9 ne catalyse pas le traitement ; elle stabilise le duplex pré-crRNA:tracrRNA, permettant son clivage précis par la ribonucléase III de l’hôte. Références associées : PMID:24270795

Conseils expérimentaux et recommandations techniques

• L’immunogène couvre les acides aminés 450-730 de Cas9, une région englobant le domaine nucléase HNH et le domaine d’interaction avec le PAM. Pour le western blot, envisagez d’utiliser des lysats de cellules transfectées avec Cas9 ou de la protéine Cas9 recombinante pleine longueur purifiée comme contrôle positif ; le poids moléculaire prévu est de 158 kDa.
• En immunofluorescence/ICC, la localisation de Cas9 peut varier selon l’ARN guide et la cible. Validez les conditions de fixation et de perméabilisation à l’aide de contrôles appropriés, et confirmez la spécificité en utilisant, si disponibles, des lignées cellulaires knock-out ou knock-down pour Cas9.
• Pour l’ELISA, le fragment Cas9 recombinant peut être utilisé pour établir une courbe standard ; toutefois, évaluez la réactivité croisée avec la Cas9 endogène ou d’autres membres de la famille dans la matrice biologique concernée avant toute application quantitative.
• La réactivité croisée de cet anticorps est prédite comme étant étendue, notamment avec la Cas9 humaine. Lors de l’utilisation d’échantillons provenant d’autres espèces, une validation initiale est recommandée afin de confirmer la réactivité attendue.

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